Tecnica e prospettive di utilizzo della citometria a flusso per la tipizzazione linfocitaria del liquido sinoviale di cane

Marchetti, Veronica and Sbrana, Silvia and Modenato, Mario and Isola, Patrizia and Pistello, Mauro and Luchetti, Elena and Cardini, Giovanni (2004) Tecnica e prospettive di utilizzo della citometria a flusso per la tipizzazione linfocitaria del liquido sinoviale di cane. Annali della Facoltà di Medicina veterinaria, LVII/2 . pp. 97-106. ISSN 0365-4729

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Abstract

RIASSUNTO L’utilizzo della citometria a flusso, o fluorimetria, per l’immunofenotipizzazione linfocitaria è una metodica in uso in medicina umana soprattutto nel settore reumatologico, dove riveste un’importanza notevole nella comprensione dei meccanismi degenerativi cartilaginei in corso di artrite reumatoide, mentre è poco utilizzata nella più comune artrosi. In medicina veterinaria la tecnica non è a tutt’oggi utilizzata nella diagnostica collaterale dei problemi ortopedici e reumatologici. Sono disponibili solo due segnalazioni di lavori sperimentali in argomento. Sono state fatte numerose prove su campioni di liquido sinoviale di cane, prelevato sia durante la visita clinica che in sede intraoperatoria, in corso di patologie articolari diverse. Il liquido è stato sottoposto a conta cellulare con contaglobuli elettronico; per essere processato a tal fine e per l’analisi citofluorimetrica, è stato sottoposto a pretrattamento con jaluronidasi. La componente cellulare mononucleata è stata quindi separata e concentrata mediante centrifugazione in gradiente di densità su LymphoprepTM (Ficoll-Isopaque) e studiata con citofluorimetro. Contemporaneamente l’immunofenotipizzazione linfocitaria è stata condotta anche su un campione di sangue periferico. Prove successive finalizzate a rendere il campione un fluido acquoso hanno permesso di evidenziare l’assoluta necessità di pretrattare il campione con 2 gocce di jaluronidasi alla concentrazione di 150UI/ml per 0,25 cc di liquido sinoviale. La quantità di liquido prelevabile è in generale scarsa nei fatti degenerativi cronici, più abbondante nei fenomeni infiammatori acuti, e questo può rappresentare un limite nell’applicazione di questa metodica nella pratica clinica. Per ottenere una buona lettura è necessario avere infatti almeno 1cc di liquido articolare e/o almeno 1000 cellule/μl. La distribuzione delle sottopopolazioni linfocitarie CD3+ e CD21+, ed in particolare del rapporto fra i linfociti CD4+ e CD8+ nel liquido sinoviale e nel sangue, si presenta indicativamente diversa nei fenomeni prevalentemente degenerativi rispetto a quelli squisitamente infiammatori. La tipizzazione linfocitaria nel liquido sinoviale del cane può aprire la strada ad ulteriori indagini per studiare più a fondo i meccanismi eziopatogenetici alla base della condrodegenerazione e della risposta locale e sistemica nei fenomeni osteoartritici e immunitari, oltreché fornire una ausilio nell’individuazione e nel monitoraggio delle terapie. SUMMARY The use of flow cytometry, also called cytofluorimetry, for lymphocyte immunophenotyping is a technique adopted in uman medicine, especially in the rheumatoid field, where is of paramount importance to understand the cartilage degenerative mechanisms during rheumatoid arthritis, while is less used in degenerative joint disease. Till now in veterinary medicine this technique is not included in the ancillary diagnostic methods for orthopaedic and rheumatologic problems. To date only two papers are available about its experimental use. Several tests were done on canine synovial fluid samples, collected during the clinical examination or intraoperatively, in subjects with different joint diseases. The synovial fluid was submit for total cell count with electronic cell-counter; for this purpose and for cytofluorimetric examination too was pre-treated with jaluronidasis. The mononuclear cell phase was then separated and concentrated by centrifugation on LymphoprepTM (Ficoll-Isopaque) and studied with cytofluorimetry. In the mean time the lymphocyte immunophenotyping was performed also on a peripheral blood sample. Further tests aimed to transform the sample in an aqueous fluid has shown the absolute necessity to pre-treat the sample with two drops of jaluronidasis 150 UI/ml in 0,25 cc of synovial fluid. In chronic degenerative joint disease only few drops of synovial fluid can be collected from joints, while more abundant quantities could came from acute inflammatory cases, and this could represent a limit for the applications of the technique in the clinical practice. To perform a good examination we need at least 1cc of synovial fluid and/or at least 1000 cells/μl. Lymphocyte CD3+ and CD21+ subpopulation distribution, and especially CD4+/CD8+ ratio in blood and synovial fluid, shows differences in prevalently degenerative and mainly inflammatory phenomena. The lymphocyte immunophenotyping of canine synovial fluid can represent an alternative instrument to deeply analyze the aetiopathogenetic mechanisms settled at the basis of chondrodegeneration and of the local and systemic response to osteoarthritic and immunological phenomena, and to help in therapeutic choice and monitoring.

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