Effetto della variazione di temperatura sulla reazione di derivatizzazione post colonna con ortoftalaldeide dei dipeptidi istidinici e loro componenti

Ducci, Michele and Pacchini, Sara and Niccolini, Alberto and Della Longa, Augusto and Gazzano, Angelo and Bobowiec, Ryszard and Martelli, Franco (2004) Effetto della variazione di temperatura sulla reazione di derivatizzazione post colonna con ortoftalaldeide dei dipeptidi istidinici e loro componenti. Annali della Facoltà di Medicina veterinaria, LVII/2 . pp. 181-188. ISSN 0365-4729

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Abstract

RIASSUNTO Scopo della ricerca è stato quello di effettuare la derivatizzazione post colonna con ortoftalaldeide (OPA) dei dipeptidi istidinici (carnosina e anserina) e dei loro componenti (listidina e 3-metil-l-istidina) a varie temperature in modo da determinare quella alla quale tali sostanze producono la massima risposta in termini quantitativi. Per quanto riguarda i dipeptidi istidinici la temperatura ottimale per la reazione di derivatizzazione con OPA va dai 35°C per la carnosina ai 45°C - 50°C per l’anserina con un aumento rispettivo della superficie dei picchi di circa il 4% e 9% rispetto alla temperatura di 30°C. L’interpolazione dei dati della temperatura e della superficie dei picchi dei due dipeptidi, visto l’andamento non lineare, è stata effettuata rispettivamente con equazione polinomiale di terzo grado (R2= 0,990) e quarto grado (R2=0,992). Per la l-istidina e 3-metil-l-istidina la temperatura ottimale risulta quella compresa tra i 55°C e i 60°C ma in questo caso si osserva un incremento costante della superficie del picco con l’aumentare della temperatura (R2=0,998 per la l-istidina e un R2=0,999 per la 3- metil-l-istidina). Per questi ultimi due componenti l’aumento della superficie dei picchi rispetto alla temperatura di 30°C risulta essere molto elevato (?70%). La riproducibilità dei valori delle superfici dei picchi sia dei dipeptidi istidinici che dei loro componenti risulta elevata, con un bassissimo coefficiente di variazione a tutte le temperature utilizzate, mostrando come la reazione di derivatizzazione sia altamente stabile. Questi dati mostrano come l’incremento di sensibilità e quindi della superficie del picco al variare della temperatura di derivatizzazione ed a parità di concentrazione sia ridotto per i dipeptidi istidinici mentre sia notevolmente elevato per i loro componenti. In conclusione questa ricerca mostra come con l’aumentare della temperatura sia possibile aumentare l’efficienza, la sensibilità e l’accuratezza della metodica HPLC usata per la determinazione di questi composti che risultano presenti in molti compartimenti dell’organismo in concentrazioni ampiamente variabili in quanto specie specifiche ed anche quantitativamente molto ridotte specialmente per quanto riguarda la 3-metil-l-istidina. SUMMARY The aim of this research was to make the o-phthalaldehyde (OPA) post-column derivatisation at different temperatures of histidine dipeptides (carnosine, anserine), L-histidine and 3-methyl-L-histidine to establish which temperature is the best to obtain highest sensibility of detection of this compounds. As regard anserine and carnosine, results showed that the best temperature of derivatisation reaction was between 45°C - 50°C for anserine and between 35-45 °C for carnosine with an increase of peak area of 9% respect to temperature of 30 °C. For L-histidine and 3-methyl-Lhistidine this research showed that the optimal temperature was between 55°C - 60°C with an increase of peak area at every temperature of derivatisation reaction (R2=0,998 for L-histidine and R2=0,999 for 3-methyl-L-histidine). For this latter the increase of peak area respect to temperature of 30 °C was more of 70 %. The reproducibility of the method (for histidine dipeptides, L-histidine and 3-methyl-Lhistidine) was very high with a very low coefficient of variation at all temperatures of derivatisation; it showed that the derivatisation reaction was very stable. Therefore all data showed that the increase of sensibility (associated to growing of temperature) was very high for histidine and 3-methyl-L-histidine while it was reduced for histidine dipeptides. In conclusion this research showed that the increase of derivatisation. temperature permitted to obtain an higher sensibility efficiency of HPLC method used for detection of histidine dipeptides that are present in animal tissues at different and very low concentrations.

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